Βιολογία Θετικής κατεύθυνσης Γ τάξης Ενιαίου Λυκείου Κεφ.4. Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA
2016-08-22 16:06
Τι θα πρέπει να καταλάβουμε από το βιβλίο της Βιολογίας θετικής Κατεύθυνσης Γ τάξης Ενιαίου Λυκείου. Μια προσπάθεια να τονίστουν τα βασικά σημεία του μαθήματος με στόχο την κατανόησή του
από την Δήμητρα Σπανού χημικό, καθηγήτρια Δευτεροβάθμιας Εκ/σης 1ου Γυμνασίου Δάφνης
Χωρίς να είμαι καθηγήτρια της Βιολογίας, αλλά της Χημείας, έχοντας όμως ασχοληθεί αρκετά με αυτήν
και για λόγους γενικότερους αλλά και προσωπικούς,
θα ξεκινήσω μια προσπάθεια να δώσω με απλό και περιληπτικό τρόπο την ύλη του βιβλίου αυτού ,
τονίζοντας τα βασικά σημεία της αλλά και τις ουσιαστικές γνώσεις
που περνάν μέσα από το μάθημα,
ώστε να μπορεί ο υποψήφιος αλλά και όποιος ενδιαφέρεται να βοηθηθεί στο να πάρει μια ιδέα για τα θέματα που αναφέρονται στο βιβλίο αυτό.
Ίσως και πριν ακόμα ξεκινήσει τον αγώνα των Πανελληνίων για να καταλάβει γενικά την ύλη που πρέπει να διαβάσει.
Ξεκινώντας με την υλη...
ΒΙΟΛΟΓΙΑ
Ομάδας Προσανατολισμού Θετικών Σπουδών
Από το βιβλίο ‘’Βιολογία’’ της Γ΄ τάξης του Γενικού Λυκείου Ομάδας Προσανατολισμού Θετικών Σπουδών των Αλεπόρου-Μαρίνου Β., Αργυροκαστρίτη Α., Κομητοπούλου Α., Πιαλόγλου Π., Σγουρίτσα Β.
Κεφάλαιο 1 «Το γενετικό υλικό».
Κεφάλαιο 2 «Αντιγραφή, έκφραση και ρύθμιση της γενετικής πληροφορίας».
Κεφάλαιο 4 «Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA».
Κεφάλαιο 5 «Μενδελική κληρονομικότητα».
Κεφάλαιο 6 «Μεταλλάξεις».
Κεφάλαιο 7 «Αρχές και μεθοδολογία της Βιοτεχνολογίας» εκτός από την ενότητα ‘‘Η παραγωγή της πενικιλίνης αποτελεί σημαντικό σταθμό στην πορεία της Βιοτεχνολογίας’’
Κεφάλαιο 8 «Εφαρμογές της Βιοτεχνολογίας στην Ιατρική» εκτός από τις ενότητες ‘‘Εμβόλια’’ και ‘‘Αντιβιοτικά’’.
Κεφάλαιο 9 «Εφαρμογές της Βιοτεχνολογίας στη γεωργία και την κτηνοτροφία».
Κεφάλαιο 4 «Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA».
...Μπαίνουμε σ' έναν καινούριο αιώνα και μια καινούρια χιλιετία γεμάτοι από υποσχέσειςκαι προσδοκίες που σκιάζονται από αυξανόμενες ανησυχίες και αμφιβολίες. Ελπίζ αυτό το βιβλίονα συμβάλει σε μια στοχαστική συζήτηση των δυνατοτήτων και των επιλογών που βρίσκονται μπροστά μας.
Τζέρεμι Ρίφτκιν
Εισαγωγή από το βιβλίο 'Ο αιώνας της Βιοτεχνολιγίας"
Η ανακάλυψη της τρισδιάστατης δομής του DNA το 1953 ήταν η αρχή για την ανάπτυξη της τεχνολογίας DNA που συνέχισε με την ανάπτυξη τεχνικών αναπαραγωγής του, μεταγραφής του, μετάφρασης, κ.α. σε εργαστήριο (in vitro) στην συνέχεια.
(σελ 57)
Για να αναπτυχθούν τεχνολογίες παρέμβασης στο DNA χρειάστηκε η ανακάλυψη καταγραφή έρευνα πολυάριθμων ενζύμων που "κόβουν το DNA, που αποσπούν κομμάτια αυτού, μεταφέρουν ουσίες απαραίτητες , που ενεργοποιούν περιοχές, Η απομόνωση πολυάριθμων ενζύμων που χρησιμοποιήθηκαν σαν "χειρουργικά εργαλεία"
(Πρέπει να θυμηθούμε πως οι πορείες των βιολογικών αντιδράσεων καθορίζονται κυριως από τα ένζυμα που επιδρούν)
Έτσι, οδηγήθηκαν στις μετέπειτα εξελίξεις που φτάνουν έως την γενετική μηχανική των ημερών μας
δηλαδή
Η γενετική μηχανική είναι
το σύνολο των τεχνικών με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό
Ιδιέταιρα ενδιαφέρει εδώ η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA, με την οποία μεταφέρεται γενετικό υλικό, από έναν οργανισμό σε άλλον
Εδώ θα αναφερθούν τα βήματα που απαιτούνται για να περάσουν τμήματα από το γενετικό υλικό ενός οργανισμού (ενα γονίδιο ή μερικά γονίδια συνεχή) από έναν οργανισμό σε έναν άλλο (βακτήριο προς το παρόν)
Γνωρίζουμε από το κεφάλαιο 1 πως τα βακτήρια έχουν επίσης και κυκλικό DNA, μικρότερο ευέλικτό και με δυνατότητα ανταλλαγής του γενετικού υλικού του
- Πρέπει λοιπόν να αντικαταστήσουμε ένα κομμάτι από το κυκλικό DNA του βακτηρίου με ένα άλλο γονίδιο που να προέρχεται από άλλον οργανισμό
- Πρέπει να αφαιρέσουμε το γονίδιο από το DNA του άλλου οργανισμού για να το μεταφέρουμε στο πλασμίδιο και γι αυτό χρησιμοποιούμε ένζυμα Γνωρίζουμε ότι τα ένζυμα είναι απόλυτα εξειδικευμένα δηλαδή κάποια αυτά επεμβαίνουν σε ένα συγκεκριμένο σημείο (που το αναγνωρίζουν χημικά) και το κάβουν .
Αυτά λέγονται περιοριστικές ενδονουκλεάσες
- Στο κυκλικό DNA (πλασμίδιο) κόβεται με τον ίδιο τρόπο και ένζυμο ένα κομμάτι από το πλασμίδιο
- Στα σημεία που κόβονται έχουν τάση να ξαναενωθουν και έτσι μεταφέρεται το κομμάτι DNA που κόπηκε από τον πρώτο οργανισμό μέσα στο πλασμίδιο και κολά στα σημεία που αφαιρέθηκε το άλλο τμήμα του πλασμιδίου. Έτσι στο πλασμίδιο έχουμε τώρα ένα ανασυνδυασμένο DNA
- Το πλασμίδιο με το ανασυνδυασμένο DNA χρησιμοποιείται σαν όχημα για να μεταφέρει το γενετικό υλικό του μέσα σε ένα κύτταρο ξενιστή
- Το κύτταρο ξενιστής που μεταφέρθηκε το ανασυνδυασμένο DNA έχει πλέον υποστεί μετασχηματισμό. Κάθε βακτήριο από αυτά ζει και να πολλαπλασιάζεται όπως πάντα αλλά δημιουργεί μια αποικία από διαφορετικό είδος βακτηρίων που αποτελείται από κλώνους.
- Τρόποι διαχωρισμού των κλώνων για να πάρουν αυτόν που θέλουν γίνονται με ειδικούς ανιχνευτές
(σελ 60)Το DNA του οργανισμού κόβεται σε γονίδια και ταξινομείται σε γονιδιωματική βιβλιοθήκη
genomic library DNA
Η δημιουργία ανασυνδυασμένου DNA ήταν η αρχή μιας νέας εποχής που έφερε μεγάλες αλλαγές στις τελευταίες δεκαετίες. Πολλές εταιρείες ενδιαφέρθηκαν γιατί αυτή η τεχνολογία είχε τεράστια οικονομικά οφέλη. Για τον λόγο αυτό επίσης αγνόησαν τα προβλήματα και τις επικίνδυνες παρενέργειες.
Για να γίνη παραγωγή τέτοιων ειδών με ανασυνδυασμένο DNA, έγινε ένα πρώτο βήμα που ήταν να βρίσκονταιοργανωμένα τα γονίδια του οργανισμού και να εισάγονται για την δημιουργία του επιθυμητου κλώνου. Έτσι φτιάχθηκαν αποθέματα κομένων γονιδίων, που εισήχθησαν σε βακτήρια και ταξινομήθηκαν για να τα βρίσκονται εύκολα, σε "βιβλιοθήκες γονιδίων" ή γονιδιωματικές βιβλιοθήκες 
Σε αυτό βοήθησε ένζυμα που ονομάζονται περιοριστικές ενδονουκλεάσες και που είναι ένζυμα βακτηρίων που κατακοματιάζουν κάθε ξένο DNA που θα εισέλθει στο κύτταρο με στόχο την προστασία του.
Όπως είπαμε,
Η παρέμβαση αυτή γίνεται όταν αυτές οι ενδονουκλεάσες συναντήσουν μια συγκεκριμένη σειρά ενός αριθμού βάσεων στην αλληλουχία των βάσεων του ξένου DNA .Τότε επιδρούν και σταματούν "κόβουν" kάθε αλυσίδα το ξένο DNA στο σημείο αυτό. Και επειδή οι επιδράσεις αυτές ισχύουν σχεδόν για όλους τους οργανισμούς, με την επίδραση των ενδονουκλεάσων αυτών
το DNA του οργανισμού που θέλουμε τα γονίδιά του σπάει σε χιλιάδες κομμάτια
Κόβεται επίσης με την επίδραση ίδιων ενδονουκλεασών και το κυκλικό DNA (πλασμίδιο) βακτηρίου και αναμειγνύεται με το γονίδιο που θέλουν να εισάγουν. Κολλά εύκολα γιατι έχει ίδια χημικά άκρα, εφ όσον έχουν κοπει από τις ίδιες ενδονουκλεάσες στις ίδιες αλληλουχίες βάσεων του DNA τους (που ο κώδικας είναι καθολικός και ισχύει για όλους τους οργανισμούς).
Αργότερα, ανάλογα τι θέλουν να πετύχουν, εισάγουν τα αναδυνδυασμένα πλασμίδια σε άλλους οργανισμούς όπως είδαμε. Αν οι νέοι οργανισμοί είναι βακτήρια , όσοι έχουν το ανασυνδυασμένο DNA δημιουργούν κλώνο που διαχωρίζεται στην συνέχεια και μπορεί να εκφράσει το ξένο γονίδιο, δηλαδή να παράγει μια ή περισσότερες ξένες πρωτείνες που σημαίνει να εμφανίζει άλλες ιδιότητες που δεν είχε φυσιολογικά.
Η διαδικασία δημιουργίας κλώνων βακτηρίων ονομάζεται κλωνοπόιηση και
το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχει το DNA ενός οργανισμού ονομάζεται γονιδιακή βιβλιοθήκη
Κλωνοποίηση σε πλασμίδια είναι σχετικά απλή
(σελ 60)
Γονιδιωματική βιβλιοθήκη με επιλογή των γονιδίων που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα (εξωνίων )
Γονιδιωματική βιβλιοθήκη cDNA (genomic library cDNA)
Χρειάζεται να γίνει αποθήκευση σε μορφή γονιδιωνατικής βιβλιωθήκης όχι όλων των γονιδίων του DNA ενός οργανισμού (από αυτά πολλά εκφράζονται μόνο σε ορισμένους κυτταρικούς τύπους οπότε δεν ενδιαφέρουν)
Για να είναι η γονιδιωματική βιβλιοθήκη λειτουργική, δεν πρέπει να επιλέξουμε όλα τα γονίδια αλλά,
ταγονιδια που μεταφέρονται μέσω του mRNA γιατι αυτά θα μεταφραστούν με την πρωτεινοσύνθεση. 
Για να κατασκευαστεί μια τέτοια βιβλιοθήκη δεν χρησιμοποιείται το πυρηνικό DNA που περιέχει το σύνολο των γονιδίων αλλά το mRNA που μεταφέρει μόνο την πληροφορία που εκφράζεται . Έτσι απομονώνεται το ώριμο RNA και χρησιμοποιείται σαν καλούπι για την σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA Για να το πετύχει χρησιμοποιεί το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση . (στην κανονική από το DNA μεταγράφεται το RNA ενώ εδώ αντίστροφα)
(να θυμηθούμε πως οι πορείες των βιολογικών αντιδράσεων καθορίζονται κυριως από τα ένζυμα που επιδρούν)
Παράγεται cDNA (complementary DNA ) και σχηματίζονται υβριδικά μόρια cDNA-mRNA.
(Το λέμε υβριδικό γιατί είναι ένας συνδυασμός που δεν υπάρχει στους φυσιολογικούς κύκλους)
Το mRNA αποχωρίζεται, διασπάται και αποσυντίθεταιι με θέμανση
ενώ τα cDNA βρίσκουν τα συμπληρωματικά τους και δίνουν κανονικό διπλής έλικας μόρια DNA.
Από εδώ η συνέχεια είναι πανομοιότυπη με τα προηγούμενη DNA ολικής βιβλιοθήκης. Τα μόρια εισάγονται σε πλασμίδια ή βακτηριοφάγους και κλωνοποιούνται όπως προηγούμενα.
(σελ 60-61)
Ανίχνευση κλώνων γονιδιώματος ή c DNA βιβλιοθήκης
Για να διαπιστώσουμε εάν ένας κλώνος ή μια ολόκληρη cDNA βιβλιοθηκη
ανήκει σε ένα DNA γνωστού οργανισμού, χρησιμοποιούμε την εξής τεχνική:
Απομονώνουμε το συνολικό DNA του γνωστού οργανισμού με τον εξης τρόπο: Σπάμε τους δεσμούς υρδογόνου μεταξύ των συμπληρωματικών αλυσίδων, με θέρμανση ή με κατάλληλες χημικές ουσίες, και τις αποχωρίζουμε.
Τις διαχωρισμένες αλυσίδες μπορούμε να υβρυδοποιήσουμε με τις άγνωστες μονόκλωνες αλυσίδες DNA ( άγνωστο κλώνο), ή τo mRNA του οποίου δεν γνωρίζουμε την προέλευση. Εάν υπάρξει αυτή η σύνδεση, ή εάν γίνει υβρυδοποίηση με την κατασκευή συμπληρωματικών DNA-RNA, αυτό σημαίνει πως το άγνωστης προέλευσης γενετικό υλικό ανήκει στον γνωστό οργανισμό, εφ όσον μπορεί να συνδεθεί. Έτσι ταυτοποιούμε το άγνωστο γενετικό υλικό.
Αλλά ισχύει και το αντίθετο. Σε μια γονιδιακή βιβλιοθήκη DNA υπάρχουν κλωνοποιημένα όλα τα μέρη του. Κομμάτια DNA που είναι ολόκληρα γονίδια, κομμάτια που δεν είναι γονίδια, κομμάτια DNA που είναι ένα μέρος από το γονίδιο , άλλα κομμάτια DNA που δεν κωδικωποιούν πρωτείνες . Εάν από αυτά θέλουμε να εντοπίσουμε κάποιο συγκεκριμένο, χρησιμοποιούμε γνωστά (ιχνοθετημένα) μόρια DNA ή RNA που περιέχει αλληλουχίες βάσεων συμπληρωματικές προς το κλωνοποιημένο μόριο. Έτσι εντοπιζουμε αυτά που ζητάμε εφ όσον θα υβριδοποιηθούν με τα συμπληρωματιά τους. Με τον τρόπο αυτό μπορούμε να απομονώσουμε τα γονίδια που χρειαζόμαστε από μια ολόκληρη βιβλιοθήκη γονιδίων .
(σελ 61)
Πολλαπλασιασμός των γονιδίων ή των τμημάτων DNA (αλληλουχιών βάσεων) που εντοπίσαμε
Γιατί ένα γονίδιο δεν είναι αρκετό είτε για την μελέτη του ή για την παραγωγή πρωτεινών (που μπορεί να χρειάζεται μια αρκετή ποσότητα)
Εάν έχουμε απομονώσει τον βακτηριακό κλώνο που περιέχει το επιθυμητό γονίδιο, μπορούμε να τον πολλαπλασιάσουμε (μαζύ και το γονίδιο) και δημιουργούμε πολλά αντίγραφα
Με μια ειδική μέθοδο είναι δυνατό να αντιγραφούν ειδικές αλληλουχίες DNA μέσα από ένα σύνθετο μείγμα DNA, Και η αντιγραφή να γίνει εκατομμύρια φορές χωρίς την μεσολάβηση ζωντανού κυττάρου.
Εφαρμόζεται από το 1985 με πολλές εφαρμογές στην ιατρική, στην εγκληματολογία, στην μελέτη, στα απολιθώματα
Δήμητρα Σπανού
ΠΗΓΕΣ
ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ Γ ΕΝΙΑΙΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΟΕΔΒ